发布日期：2024-11-12 09:03 点击次数：188
千里积物是水生态系统中氮、磷等物资轮回的报复场地[1-2]。千里积物微生物通过同化、异化等代谢经由来影响千里积物中氮、磷、碳等生源要素的矿化及生物地球化学轮回经由酒色网小说， 是水生态系统的报复组成部分[3]， 在督察水体环境郑重的经由中起着动植物无法取代的作用[4]。另外， 微生物对其周围环境变化十分敏锐， 其生态系统中的微生物种种性及群落结构特征常可行动环境变化的招引因子[5-6]。因此， 全面了解水生态系统中千里积物微生物群落组成及漫步特征， 对于惩处和爱戴水生态环境具有潜入的意思意思。跟着分子生物学的发展， 具有准确度高、通量大、老本便宜等优点的高通量测序时期在水体、千里积物、泥土微生物群落结构议论中得到世俗应用[7]。已有学者期骗高通量测序时期对鄱阳湖典型湿地[8]、丹江口库区上层千里积物[9]、辽河口千里积物[10]微生物种种性和群落结构特征进行了议论。
黄河是中国朔方的报复水系。黄河内蒙古段自宁夏入内蒙古境内后呈拱形走向， 在榆树湾出境， 全长约800多公里。内蒙古西部有五个沙漠， 黄河内蒙古段河说念泥沙淤积主要来源于内蒙古境内的乌兰布和沙漠和库布都沙漠[11]， 每年借风力约有两亿吨沙尘刮入黄河流域， 含沙量很大， 在黄河总共河段中具有一定典型性和代表性。对黄河内蒙古段千里积物-水界面间的议论主要联结在生源要素磷[12-14]、氮[15-16]在千里积物-水界面间的吸附解吸特征偏激与千里积物理化性质间的关系， 对黄河内蒙古段千里积物微生物种种性和群落结构类型议论较少。因此， 本议论通过Illumina Miseq高通量测序时期分析黄河内蒙古段上层千里积物细菌种种性、品貌和群落结构类型， 接头细菌群落与环境因子间的关系， 了解千里积物细菌对生源要素氮、磷转动的开端作用， 为其生物地球化学轮回提供参考， 并为黄河生态环境惩处及微生物资源调控和期骗提供科学依据。
1 材料与步调 1.1 议论区概况黄河内蒙古段自宁夏入内蒙古境内后率先参加乌海市， 呈几形走向， 在榆树湾出境， 全长约800多公里。黄河内蒙古流域衔接内蒙古中部主要的工业、农业区， 是沿岸城市住户活命用水的主要来源。流域内盆地是报复的食粮分娩基地。同期东说念主类的分娩活动也日渐影响着黄河流域的水生生态系统。本实践所用千里积物样品分别从乌海市、临河、乌拉特前旗、包头市、托县和老牛湾6个地区收罗， 千里积物样品编号按序定为H1、H2、H3、H4、H5、H6。乌海市是典型的煤矿区域， 受周围煤矿及洗煤厂的影响比较大；临河、乌拉特前旗是内蒙古典型的农业区， 属于着名的河套平原区域；包头市是内蒙经济相对发达的工业城市， 有包钢等大型企业；托县为普通袖珍县城；老牛湾是着名旅游景点， 在夏令及秋季每年参不雅和游览的东说念主较多。6个采样点漫步图见图 1。
1.2 样品收罗与千里积物理化测定采样时间为2016年7月份。在样品收罗现场， 用便携式水质监测仪现场测定千里积物的温度、氧化规复电位、电导率、熔化氧和pH。采用大小适当的柱状采样器收罗0—10 cm上层千里积物， 每个采样点收罗3个同样样， 放入收罗袋中， 雪柜冷藏待测。上覆水水质目的见表 1。
黄河上层千里积物样品分析目的包括阳离子交换量(Ion exchange capacitiy)、有机质(Total organic carbon)、总磷(Total phosphorus)、烧失量(Burning vector)。阳离子交换量参照EDTA-铵盐快速法测定， 有机质取舍重铬酸钾法来测定， 总磷测定取舍过硫酸钾氧化消解法测定。
1.2 样品分析 1.2.1 PCR扩增提真金不怕火的样品DNA先用琼脂糖凝胶电泳检测， 详情检测及格之后再通过荧光定量PCR时期检测。Bact-F(5′-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3′)和Bact-R(5′-ACCAGGGTATCTTAATCCTGTT-3′)为本文采用的引物。其中， PCR反应体系包含2.5 μL 10 × PCR缓冲液， 1.6 μL dNTP (2.5 mmol/L， TaKaRa)， 1 μL高卑鄙引物(10 μmol/L)， 0.125 μL rTaq DNA团员酶(5 U/μL)， 模版DNA 2 μL， 最终用去离子水补充至16.73 μL。反应条款树立为95 ℃预变性4 min， 30个轮回， 95 ℃变性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃蔓延30 s， 最终72℃蔓延10 min。最终要得到顺应MiSeq高通量测序要求的地点DNA片断。
1.2.2 Miseq平台高通量测序16S数据库测序是指对环境样品微生物的16S rDNA基因的PCR扩增居品进行高通量测序后将测序数据与已有的16S rDNA数据库进行比对分析， 对环境样品中的微生物群落种种性进行议论。其中PCR反应的30 μL体系包含15 μL高保真PCR搀和剂(New Eng-land Biolabs)， 0. 2 μmol/L的正反引物以及2 μL的模版DNA。PCR反应条款为95 ℃预变性5 min， 40个轮回， 57 ℃退火30 s， 72 ℃蔓延20 s， 72 ℃最终蔓延5 min。PCR居品通过琼脂糖凝胶电泳检测并详情及格后在Illumina MiSeq平台进行更进一步测序。
1.2.3 测序数据处理扩增序列的处理主要包括截去条形码和引物序列。最终通过Flash1.2.7软件对序列进行拼接和用Qiime19.1.0等软件进行愈加精准与严格的序列质地检测和筛选得到有用序列。其中碱基测序精准进程用Q值示意， 然后取舍UCLUST等步调进行OTU(operational taxonomic unit)聚类， 并将把物种操作单元之间的相似性就是或大于97%的有用序列归为兼并分类单元。基于OTU分析效用不错进行多种样品稀释性弧线分析并算计Chao1品貌指数、遮盖度(Coverage)和香农(Shannon)种种性指数。取舍RDF Classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析。
2 效用与分析 2.1 千里积物样品微生物种种性分析群落生态学中， α种种性主要护理单样本的种种性分析， 不错反馈微生物群落中物种的数量， 通过一系列统计学指数的分析来臆想环境群落的物种品貌和种种性。6个采样点的千里积物样品所得回的种种性数据列于表 2。由表 2可知， 6个采样点的千里积物样品ACE种种性指数在6758.63—12958.81之间， Chao1种种性指数范围在6079.61—11525.45内。ACE和Chao1种种性指数标明千里积物样品细菌品貌， 其数值越大， 样品细菌品貌就越高。6个样品细菌群落品貌大小为：H3 > H6 > H2 > H4 > H5 > H1。香农威纳种种性指数在9.46—10.57以内， 其数值比较高， 说明6个采样点都具有比较高的微生物种种性， 其排序效用为：H6 > H2 > H5 > H4 > H3 > H1。与其他5个采样点比拟， H1点的细菌群落品貌及微生物种种性显著都比较低。表中Coverage示意测序深度， 从其值来看， 除了H1和H5较低外， 其尾数值都比较高， 高达96%， 说明各样本文库的遮盖率比较全面， 序列莫得被测出的概率较低。该效用与本议论中稀释弧线展望效用一致。
黄河内蒙古段6种上层千里积物样品主坐标分析如图 2所示。由图可见酒色网小说， 第一主轴(PC1)， 第二主轴(PC2)和第三主轴(PC3)的奉献率分别为50.37%， 30.14%和10.67%。图中H3和H4之间的距离最近， 标明两者的千里积物微生物群落组成及品貌都左近。H6和H2， H6和H5千里积物微生物群落构和品貌也比较左近， 但相似性小于H3和H4千里积物样品微生物组成。H1与其他5种千里积物样品微生物群落组成之间各异都比较大。这与咱们基于高通量测序的微生物种种性和品貌议论中所得出的效用一致， 乌海(H1)千里积物样品微生物种种性和品貌在6种样品中都是最低。
2.2 黄河千里积物样品细菌群落结构及类型本议论6个采样点千里积物样品的36447个OTUS分属于365个门， 1128个纲， 2170个目， 3360个科， 4722个属， 可见黄河内蒙古段千里积物有着比较丰富的微生物种种性。通过与Green gene database中的已知序列进行比对后， 对黄河千里积物样本中的细菌群落结构有了初步的了解。黄河上层千里积物样品主要细菌种类在门提要科属水平上的相对品貌见图 3至图 7。由图可见， 黄河千里积物样本细菌群落在门水平上， 变形菌门(Proteobacteria， 相对品貌为32.39)、绿弯菌门(Chloroflexi， 相对品貌为13.25%)、拟杆菌门(Bacteroidetes， 相对品貌为12.16%)占据了总细菌群落品貌的50%以上。说明这三类细菌在黄河内蒙古段千里积物中为上风菌群。在变形菌门中发现的主要种类有α-变形菌纲(AlphaProteobacteria)， β-变形菌纲(BetaProteobacteria)， γ-变形菌纲(GammaProteobacteria)， δ-变形菌纲(DeltaProteobacteria)等四种， 其中β-变形菌纲占据了变形菌总品貌的36.98%， δ-变形菌纲所占相对品貌为23.86%， α-变形菌纲所占相对品貌为20.89%， γ-变形菌纲所占相对品貌为15.86%。由此可见， β-变形菌纲在黄河内蒙古段千里积物中生态位置中占据比较报复的位置。
本议论中发现的含量比较多的细菌类群还包括后壁菌门(Firmicutes， 相对品貌为7.71)， 酸杆菌门(Acidobacteria， 相对品貌为6.15)， 放线菌门(Actinobacteria， 相对品貌为7.10)， 它们的相对品貌均在6%以上。本议论还发现了芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)， 疣微菌门(Verrucomicrobiae)， 蓝细菌门(Cyanobacteria)， 硝化螺旋菌门(Nitrospira)， 螺旋体门(Spirochaetes)， 绿菌门(Chlorobi)， 梭杆菌门(Fusobacteres)， 浮霉菌门(Planctonycetes)等相对品貌比较少的种群。此外， 在咱们的比对效用中有5%的细菌16S rRNA基因序列在基因库中没找到相似序列或所占比十分少， 是以将其一并差异为其他(Other)， 这些序列也许是于今为止尚未被发现的一些新的微生物种类或是在这个环境中从来没培养的微生物的一部分。
2.3 黄河千里积物微生物种种性与环境因子之间的关系千里积物理化目的测定效用见表 3。CEC最大值是乌海千里积物， 最小值是乌拉特前旗；TOC最大值是乌海千里积物， 最小值是乌拉特前旗；TP最大值是乌海千里积物， 最小值是老牛湾；LOI最大值是乌海千里积物， 最小值是包头。
黄河内蒙古段上层千里积物门分类水平上的细菌群落与环境因子之间的冗余分析效用如图 8所示。分析效用败露， 千里积物中TOC、CEC和TP等环境因子对黄河内蒙古段千里积物细菌群落漫步影响较大。有议论报说念对细菌群落偏激环境影响因子进行冗余分析(RDA)[3， 17-18]效用标明， 发现TOC、总氮(TN)、TP等环境因子对千里积物细菌漫步影响权贵， 与本议论所得效用基本一致。
黄河内蒙古段上层千里积物微生物种种性指数与各花式氮和环境理化因子作念揣度性分析效用见表 4。数据处理中使用SPSS Statistics19.0软件对各组数据进行双变量揣度性分析， 得出权贵性概率P值(*：P < 0.05， 说明0.05水平(双侧)权贵揣度)。从表 4可知， 黄河千里积物各样品细菌群落种种性Chao1和ACE指数与千里积物中TN、TP呈权贵负揣度， 说明黄河千里积物细菌群落品貌的大小对氮磷等营养物资的损耗有胜利关系；与千里积物中铁锰氧化态氮(IMOF-N)、碳酸盐结合态氮(CF-N)呈权贵负揣度， 可能对可转动态氮的开释与转动有着很权贵的影响。而Shannon指数仅与IMOF-N、CF-N呈权贵负揣度， 说明微生物群落的种种性对铁锰氧化态氮和碳酸盐结合态氮的开释有促进作用。千里积物CEC的大小基本上代表了千里积物可能保抓的营养， 这三种指数均与CEC呈权贵负揣度关系， 说明微生物群落的种种性会铺张千里积物营养。揣度性分析效用标明， 大厚情况下微生物群落种种性及品貌在不同进程上会促进氮花式的转动和开释， 但其经由复杂种种， 因此微生物在氮花式转动中的具体作用还需进一步探索和议论。
3 参议 3.1 上风细菌组成及功能物种种种性是督察生态系统平淡功能的前提条款[19]。对6个黄河上层千里积物细菌群落组成进行议论， 发现其主要由变形菌门(Proteobacteria， 32.39%)、绿弯菌门(Chloroflexi， 13.25%)、拟杆菌门(Bacteroidetes， 12.16%)， 后壁菌门(Firmicutes， 7.71%)， 酸杆菌门(Acidobacteria， 6.15%)， 放线菌门(Actinobacteria， 7.10%)组成， 序列总额占沿途序列的78.76%， 说明这六类细菌在黄河内蒙古段千里积物中为上风菌群， 阐扬出群落组成的丰富性。黄河千里积物细菌群落组成与之前议论的黄河三角洲湿地[20]、丹江口库区[9]、太湖[21]、北运河[22]等河流偏激海洋[23]等水体的千里积物细菌组成类群相似， 但又有区别。王鹏等[8]鄱阳湖典型湿田主要菌群为变形菌门、酸杆菌们、绿弯菌门、硝化螺旋菌门、厚壁菌门等；阴星望等[9]丹江口库区上层千里积物主要菌群为变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门等；郭建丽等[24]双台子河口千里积物主要菌群是变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、酸杆菌门以及绿弯菌门。议论标明这些千里积物细菌群落的丰富性和种种性使千里积物在营养盐轮回、有机物降解、重金属花式转动等方面起着报复的生态功能[25]。
变形菌门是一大类细菌群落， 在许多细菌群落议论中都具有最高的相对品貌， 如南海北部和黄海西北部千里积物[26-27]， 但在不同海域上层千里积物基因文库中所占的比例各异较大， 卡斯卡底古陆边际次上层千里积物中变形菌门含量占文库比例高达95%[28]， 而在日本Nankai海槽1176站位次上层千里积物中， 变形菌门仅占基因文库的22%[29]。东海陆架上层千里积物中变形菌门占细菌文库近50%[30]；崇明东滩上层千里积物变形菌门占文库的比例在22.4%—34.6%[31]。本议论中黄河内蒙古段千里积物中主要的微生物类群是变形菌门， 占文库的比例为27.51—42.28%， 平均值为32.39%。
变形菌门不同纲的菌群在千里积物中的品貌变化亦然微生物群落结构议论中的一个报复目的。海洋及近海千里积物中变形菌门以γ-变形菌纲为主[32]；双台子河口千里积物中细菌种种性议论标明δ-变形菌纲占基因文库的60%， 为齐备上风菌群[24]。本议论区变形菌门主要包括(按品貌大小排序)β-变形菌纲(36.98%)、δ-变形菌纲(23.86%)、α-变形菌纲(20.89%)和γ-变形菌纲(15.86%)。α-变形菌纲和β-变形菌纲是淡水细菌群落中一个典型的上风类群[33-34]， 包括了能与植物共生的固氮细菌[35]， 可为泥土提供更强的固氮能力。β-变形菌纲频频期骗有机物领悟产生的氨气、甲烷等营养物资， β-Proteobacteria更易存活于受浑浊的环境中[36]， 它可行动环境质地监测与评价的生态目的[27]。在黄河千里积物中β-变形菌品貌最大， 推测本议论采样地点可能受到了陆源排污或其他东说念主类活动的影响。
δ-变形菌纲包含了以其他细菌为食的细菌， 对千里积物氮、磷、硫和有机质轮回有报复作用[37]。细菌群落品貌指数与TN、TP、碳酸盐结合态氮(CF-N)和铁锰氧化态氮(IMOF-N)在P < 0.05水平呈权贵负揣度关系， 说明黄河千里积物细菌群落品貌的大小与氮磷等营养物资的损耗有胜利关系。
黄河内蒙古段千里积物中相对品貌第二高的类群是绿弯菌门。绿弯菌门是一类通过光团结用， 以二氧化碳为碳源产生能量的细菌[38]， 但它们是兼性厌氧生物， 因此在光团结用中不产生氧气， 从而不成固氮。另有议论标明绿弯菌门在水位频繁变化的潮间带泥土含量较高， 黄河千里积物中较高的绿弯菌门品貌可能与其春季水位低、夏令水位升高瓜代水位变化揣度。黄河水体中相对品貌居于第三位的细菌类群是拟杆菌门。拟杆菌门世俗存在于种种环境中， 如海洋、泥土或与东说念主类活动的活命环境中， 它是大批存在的共栖类群。朝鲜东海千里积物中拟杆菌的品貌也较高[39]， 而这株菌一般来源于动物或东说念主类粪便， 因此推测本议论采样地点可能受到了陆源排污或其他东说念主类活动的影响。这些细菌类群以纲为单元中， 也主要包括变形菌纲、酸杆菌纲、黄杆菌纲、拟杆菌纲、放线菌纲等5大类群。Foulquier等[40]议论以为干湿瓜代的环境故意于一部分细菌的孕育， 恒久灭亡区和干湿瓜代区泥土的微生物群落存在结构性各异， 使得恒久灭亡区的黄河千里积物中绿弯菌门， 酸杆菌门， 厚壁菌门是与淡水生态系统中不同的菌群。
黄河千里积物中还含有少许疣微菌(相对品貌2.5%)， 对于疣微菌门的议论还很少。疣微菌门是革兰氏阴性细菌， 在海洋动物、南极沿岸千里积物和海水等环境中存在[41]， 能在厌氧条款下进行亚硝化作用。Freitas等[42]对疣微菌门在群众海洋环境的漫步和种种性的议论发现， 疣微菌在海洋千里积物细菌群落中占1.4%， Ⅰ型和Ⅳ型亚门是千里积环境中品貌最高的类群， 对海洋中碳的生物地球化学轮回有着报复作用。
3.2 细菌群落品貌的空间面容黄河千里积物细菌群落品貌大小为乌拉特前旗>老牛湾>临河>包头>托县>乌海。在这六个采样点中， 乌拉特前旗黄河沿岸是典型的农业区， 采样时间是黄河丰水期， 黄河水量仍是遮盖了春季栽培的地盘， 农民使用的化肥可能会参加水体及千里积物中， 在营养物资充分的条款下， 导致该地区的细菌群落品貌最高。聂三安等[43]议论施肥对微生物群落结构和种种性的影响， 发现施肥处理泥土中部分微生物群落的相对品貌高于不施肥处理的泥土， 说明施肥大要为微生群落提供讲究的孕育环境。是以， 农业区微生物群落品貌较高， 这与本实践样品中典型农业区-乌拉特前旗的细菌群落品貌较高的效用相符。其次是老牛湾采样点， 老牛湾是着名的旅游地区， 多年东说念主类活动的影响对老牛湾的水质及千里积物有一定影响， 其地舆位置处于悬崖围绕中， 温度等当然条款相对柔顺， 其细菌群落品貌较高。
杨超越 ai换脸乌海千里积物中细菌品貌和微生物种种性都是最低的一个采样点。乌海地区是产煤地区， 流经乌海的黄河由于受周围煤矿及洗煤厂的影响， 黄河水的表情偏灰黑， 是所采样品中生态环境较差的一个区域。本议论六个样品中乌海千里积物中CEC、TOC、TP、LOI含量最高， 丰富的有机营养可能促进特定菌类在此富集， 可能会截至其他许多种微生物的孕育， 因而使得乌海千里积物细菌种种性指数偏低， 细菌群落品貌最低[31]。乌海千里积物中绿弯菌门所占含量很高(29.7%)， 仅次于变形菌门(30.2%)；厌氧绳菌纲(Anaerolineae)在纲水平中含量最高， 达到27%；在属水平中硫杆菌含量最高， 达到5.5%。乌海千里积物中绿弯菌门是六个采样点中最高的采样点， 这些数外传明乌海段黄河水水质与其他采样点水质存在各异， 该效用与望塘浑水厂尾水排口处的议论效用一致[44]。绿弯菌门是20世纪80年代才被认同的一个新的系统发育分支， 被以为在低氧和厌氧环境中施展报复作用， 况兼乌海千里积物中厌氧绳菌纲含量最高， 这标明乌海千里积物是含氧量较低的千里积物环境。
在包头采样点中， δ-变形菌纲含量最高， 其序列与来源与受重金属和石油烃浑浊的突尼斯海峡千里积物[45]的细菌序列的相似度最高， 况兼包头是内蒙古报复的工业城市， 黄河包头段可能受重金属的影响比较大。
3.3 细菌群结巴间面容的要道影响因子议论标明， 千里积物中的总磷， 总氮， 有机质含量和pH值等环境因子都能不同进程的影响千里积物中细菌群落组成[46]。阴星望等[9]分析丹江口库区上层千里积物细菌群落与环境因子之间的揣度性发现pH值， 总磷， 氨氮和有机质含量为主要影响因子。本实践取舍了冗余分析(RDA)对黄河上层千里积物样品细菌群落和环境因子进行分析， 效用标明千里积物中的TOC、CEC和TP等环境因子对黄河内蒙古段千里积物细菌群落漫步影响较大。该效用与Liu等[46]， Song等[47]议论效用访佛。为进一步明确环境因子和细菌群落之间的揣度关系， 将微生物种种性指数与环境因子之间取舍SPSS Statistics19.0进行了揣度分析。效用发现， 微生物种种性指数与千里积物TP， TN， ECE等环境因子呈负揣度关系。戴雅婷等[48]议论也发现TN， TOC是影响细菌群落组成的报复成分， 这与本实践效用相符。经过分析， 千里积物TP， TN， CEC含量的大小基本上代表了千里积物可能含有的营养， 黄河内蒙古段千里积物细菌群落种种性指数与TP， TN， ECE等呈权贵负揣度关系， 说明微生物群落的种种性会铺张千里积物营养。
4 论断(1) 高通量测序效用标明黄河内蒙古段6个上层千里积物样品中6447个OTUS分属于365个门， 1128个纲， 2170个目， 3360个科， 4722个属。分析遮盖度数据和稀释性弧线效用标明样品中还有许多莫得分类或未培养的细菌。
(2) 变形菌门是黄河上层千里积物样品中相对品貌最高的菌门， 相对品貌高达32.39%。其次是绿弯菌门(Chloroflexi， 13.25%)、拟杆菌门(Bacteroidetes， 12.16%)、后壁菌门(Firmicutes， 7.71%)、放线菌门(Actinobacteria， 7.10%)、酸杆菌门(Acidobacteria， 6.15%)。
(3) 细菌群落品貌与环境因子之间的冗余分析效用败露酒色网小说， 千里积物中总TOC、CEC、TP和TN等环境因子对黄河内蒙古段千里积物细菌群落漫步影响较大；微生物种种性与环境理化因子揣度性分析效用标明， 黄河千里积物微生物种种性对氮磷等营养物资的损耗有胜利关系。