发布日期：2024-12-13 05:11 点击次数：199
1985年Pan等[1]初次发现，外泌体是哺乳动物网织红细胞熟识经由平分泌的直径为40~100 nm的膜性小囊泡，电子显微镜下呈茶托形或一侧凹下的半球形。外泌体由体内多样活细胞分泌，世俗分散于血液、尿液、乳汁等体液中[2]。外泌体含有丰富的卵白质、脂质、细小RNA(microRNA， miRNA)等内容物[3]姐妹花 porn，这些生物信息分子会随疾病发扬、转归发生变化，是颇具临床会诊价值的轮回记号[4-5]。因此，索要高纯度的外泌体用于后续临床会诊具有辛勤实用价值[6]。凭据外泌体的大小、密度和名义记号等物理化学性质，现在获取外泌体的门径有经典的超速离心法、千里淀法、免疫亲和拿获法、分子排阻层析等[7-11]。近几年来，德国Qiagen公司研发的外泌体索要试剂盒exoRNeasy应用膜亲和吸附旨趣，可径直获取血清外泌体的总RNA[12]，便于操作且效力高，适用于大界限索要血清标本进行后续miRNA测序和定量团聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)等实验[13]。然则，exoRNeasy操作手册律例索要血清外泌体所需模范血清量为1~4 mL， 而临床现实中患者血清标本珍稀且体积有限，能否用较少的血清量达到预期的实验成果值得探索。本持续以健康东说念主和慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者血清为样本，应用exoRNeasy Serum/Plasma Midi试剂盒索要250、500、1 000 μL血清外泌体中RNA，并对miRNA相对抒发量进行对比分析，中式能检测外泌体中miRNA的最小血清体积，为后续持续提供实验依据。
1 材料与门径 1.1 持续对象就地筛选2017年9—11月上海市专家卫生临床中心肝病科乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigen， HBeAg)阳性CHB初治患者9例，无基础疾病健康者9例。采集静脉血5 mL，加入含分离胶的促凝管，室温静置至少30 min，3 000 g离心15 min，取表层淡黄色血清约2 mL，置-80 ℃雪柜备用。本持续通过了上海市专家卫生临床中心医学伦理委员会批准，志愿者均签署了知情快乐书。
五月色播 1.2 门径 1.2.1 仪器与试剂外泌体RNA索要试剂盒为exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit(德国Qiagen公司，cat.no.77044)。透射电子显微镜型号Philips CM120(荷兰Philips公司)。兔单抗Anti-CD63 [EPR5702](ab134045)、兔单抗Anti-TSG101 [EPR7130(B)](ab125011)购自英国Abcam公司，β-actin [GT5512]购自好意思国GeneTex公司。Stepone plus及时荧光定量PCR仪购自好意思国Applied Biosystems公司。TaqManTM MicroRNA Reverse Transcription Kit购自好意思国Applied Biosystems公司，Bulge-Loop Reverse Transcription Primers购自广州市锐博生物科技有限公司，Thunderbird SYBR qPCR Mix购自日本Toyobo公司。miR-122回转录引物序列为hsa-miR-122-3p：5′-AACGCCAUUAUCACACUAA-AUA-3′，由广州市锐博生物科技生物有限公司合成。
1.2.2 血清中外泌体的索要德国Qiagen公司exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit使用膜亲和谀媚程序从血清平分离外泌体，程序简述如下。①血清梯度离心程序：4 ℃，2 000 g离心10 min，去除死细胞，取上清液链接10 000 g离心30 min；然后14 000 g离心10 min，透彻去除血清中的细胞碎屑，进行后续外泌体的索要(图 1)。②泛泛东说念主和CHB患者血清分辩取250、500、1 000 μL， 加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)稀释至总体积均为1 000 μL，然后按试剂盒阐扬书操作，可得到外泌体，用于后续浮滑。
1.2.3 外泌体生物学特质浮滑① 透射电子显微镜花样不雅察[12]：用50 μL PBS融解Qiagen试剂盒索要的1 mL血清中的外泌体。接收磷钨酸负染色法，将Parafilm膜平整黏贴于玻璃名义，50 μL样品滴于膜上，带有Formvar相沿膜的铜网掩饰在样品液滴上，使其飘摇3~10 min。将50 μL 2%磷钨酸染液滴于Parafilm膜上，用滤纸沿铜网旯旮吸干液体。白炽灯下干燥10 min， 备用。透射电子显微镜下不雅察。②卵白免疫痕迹法检测外泌体记号卵白[12]：用50 μL RIPA裂解液裂解Qiagen试剂盒索要的1 mL血清中的外泌体，进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，10~15 mA恒流电泳3~4 h。然后以湿转法将SDS-PAGE凝胶上的卵白转至硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜，用含5%脱脂奶粉的含吐温20的PBS(PBS with Tween 20，PBST)顽固液置于摇床，室温顽固1 h以上。加入一抗(1:1 000顽固液稀释)，4 ℃过夜。次日，PBST洗膜(5 min，3次)后加入相应的二抗室温反应2 h，加入化学发光底物显色不雅察。
1.2.4 血清外泌体总RNA索要及miRNA检测[14]外泌体中总RNA索要按Qiagen公司试剂盒exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit阐扬书操作。使用QIAzol裂解谀媚于离心柱膜上的外泌体，在QIAzol洗脱液中加入氯仿，回收水相与酒精夹杂。将整个液体飘舞至RNeasy MinElute离心柱中瞬离30 s，然后用Buffer RWT和RPE洗3次，离心，终末加14 μL RNase-free水，得到总RNA。取11 μL RNase-free水融解的外泌体总RNA，加入5 μL回转录引物Mix， 70 ℃甩掉10 min，冰上孵育2 min。然后加入回转录体系进行miRNA特异性回转录， 得到20 μL cDNA居品。将cDNA原液稀释4倍后，取2 μL行及时荧光定量PCR检测。反应条目：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延迟30 s，40个轮回。之外源性线虫cel-miR-39为内参基因，2-△△Ct值示意miR-122的相对抒发量。
1.3 统计学处理接收SPSS 17.0进行统计学分析。应用K-S查考对数据进行正态性查考，两组间计量数据比较接收F查考和t查考，3组间计量数据比较接收未婚分方差分析；分类贵府接收卡方查考。P＜0.05为互异有统计学真谛。
2 收敛 2.1 外泌体花样学浮滑透射电子显微镜(×46 000)不雅察表露，接收exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit得到的外泌体为大小不等的圆形至卵形囊泡状结构，可呈分散或谀媚分散，由染色较深的脂质双层膜偏捏内染色较淡的低电子密度物资构成，囊泡粒径大小多分散于40~100 nm，与文件报说念的30~150 nm基本一致(图 2)。
2.2 外泌体名义记号卵白的抒发浮滑接收卵白免疫痕迹法检测外泌体记号卵白的抒发情况。收敛表露，exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit索要的外泌体抒发其名义特异性记号卵白TSG101和CD63，但内参β-actin阴性；对照样品中TSG101和CD63低抒发，β-actin阳性。收敛标明，exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit从血清中索要的外泌体如实存在(图 3)。
2.3 及时荧光定量PCR检测从不同体积血清中索要的外泌体中miR-122的抒发miR-122是肝细胞中含量最丰富的miRNA，占肝脏总miRNA的70%，且与肝脏生理功能密切关系，它能通过谀媚病毒RNA来径直扼制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制[15]。许多持续报说念血清miR-122可看成肝脏挫伤的生物记号，且其水平与丙氨酸氨基转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、HBV DNA和HBV名义抗原(HBV surface antigen，HBsAg)密切关系[16-17]。持续标明，与泛泛东说念主比拟，CHB患者尤其是HBeAg阳性患者轮回中miR-122水平升高[18]，因此本实验中式miR-122来比较HBeAg阳性CHB患者与健康东说念主从不同量血清中索要的外泌体中miRNA抒发量。接收exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit索要CHB患者和健康东说念主血清外泌体的总RNA，回转录为cDNA后行及时荧光定量PCR检测。内参基因cel-miR-39在不同类型的样本中抒发水平明白， 轮回阈值(cycle threshold，Ct)约为13。收敛表露， CHB患者和健康东说念主的血清体积每增多1倍，Ct值递减一个轮回，PCR信号随血清体积呈线性增多。接收及时荧光定量PCR检测CHB患者和健康东说念主从不同体积血清中索要的外泌体中miR-122抒发情况，运转血清量分辩为250、500、1 000 μL，CHB患者miR-122抒发量比健康东说念主分辩上调22.44、21.48、20.69倍(P=0.42)(图 4~5)。
3 持续外泌体是由多种细胞分泌的膜性生物运输体，其内容物种类蕃昌。外泌体的生物功能有物资运输、信息传递和免疫调整等，还佩戴大批病理生理生物记号信息。外泌体被开释至体液和微环境时，可佩戴生物信息进行长距离的细胞间通信。持续标明，外泌体在临床会诊和调治中有浩大应用远景[19]，在心血管疾病[20]、神经系统疾病[21]、肿瘤[22]和肝脏疾病[23]诊治中演出着极其辛勤的变装。许多持续发现，外泌体源性miRNA可看成一种生物记号用于疾病会诊和预后。外泌体膜结构的保护使体液中外泌体源性miRNA等不易被阻滞，具有更好的抗降解才调，因此是一种理思的非侵入性“液体活检”门径[24]。
迄今为止，诚然血清外泌体的索要门径许多，但最大的局限性是衰退模范化的外泌体分离门径，以及样本的汇注和处理门径，怎样获取高质料外泌体偏捏内含物照旧困扰持续者们的一个难题。经典的差速超速离心法富集外泌体程序繁琐耗时，工夫要求高，所需血清量多；基于团聚物千里淀的门径索要的外泌体纯度低，掺杂许多杂质；基于名义卵白记号亲和分离门径得到的为某个卵白记号阳性的外泌体亚群，不成反应外泌体的举座情况[10-11]；凝胶尺寸排阻色谱分离的外泌体阻滞特异性，适合过滤尺寸内的任何微粒包括细胞碎屑、血小板和淋巴细胞等皆会被分离出来，不利于下流分析。本持续使用最新的膜亲和离心柱门径索要血清中外泌体及外泌体中RNA，可高效力、低亏本地得到外泌体RNA，稳健临床实验室使命，有意于下流的分析考据[25]。
本持续通过电子显微镜和卵白免疫痕迹法对exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit索要的外泌体生物学花样和名义记号卵白进行考据。收敛表露，外泌体在电子显微镜下表露为直径30~100 nm的脂质双层膜的囊泡状结构，其名义抒发外泌体特征性卵白TSG101和CD63，但不抒发β-actin，阐明该门径索要的如实是外泌体。exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit操作手册中模范血清量为1 mL，但当临床血清资源有限时，250或500 μL血清能否达到不异的实验成果，本持续对此进行了初步探索，用及时荧光定量PCR对CHB与健康东说念主不同体积血清中索要的外泌体miR-122抒发量进行分析。收敛表露，血清体积每增多1倍，Ct值递减1个轮回，PCR信号随血清体积呈线性增多。针对不同运转血清量，CHB患者miR-122抒发量比拟健康东说念主升高的倍数莫得统计学互异。因此，应用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit索要外泌体中miRNA考据抒发互异时，一丝血清可达到与1 mL血清沟通的收敛，这对料理临床血清资源有限这一问题有本色真谛。
本持续也存在一定局限性。领先，本持续例数较少，后续需扩大样本量，进一步评价该门径的临床应用价值。其次，关于CHB患者血清中抒发品貌较低的miRNA是否可达到沟通的考据成果，还需进一步探索。
说七说八姐妹花 porn，使用Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit索要血清外泌体时，需凭据持续的疾病、计算、下流实验盘算及本色样本量来详细接头实验使用的血清量。