发布日期：2024-12-13 03:59 点击次数：195
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网状上行激活系统(ascending reticular activating system， ARAS)发源于脑干网状结构，主要包括蓝斑、桥脚背盖区/背外侧背盖区、中缝背核(dorsal raphe， DRN)等核团[1-2]。ARAS分别发出经中脑-下丘脑-基底前脑的腹侧通路和经丘脑的背侧通路至大脑皮层，诱发皮层举止去同步化，参与皮层激昂性和醒觉状况的调控。嗅觉输入一方面经丘脑上行到嗅觉皮层，酿成嗅觉，另一方面躯体、头面部、视觉和听觉等特异性嗅觉上行传导通路经过脑干时，发出侧枝投入ARAS调控醒觉[3]。嗅觉输入具有叫醒作用，可诱发休眠向醒觉的盘曲[3-4]；裁汰嗅觉输入或嗅觉洗劫则导致醒觉水平裁汰[5]。
DRN位于脑干中缝，是ARAS的构成结构之一。DRN是5羟色胺(serotonin， 5HT)能神经元的集合漫衍脑区，同期还包含多巴胺能、谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神经元[6]。DRN神经元通过其全脑界限内的迷漫投射参与调整多种步履，如醒觉、表彰、应激、摄食和领略举止等[4， 7]。作为醒觉系统的紧要构成部分，DRN神经元在醒觉期线路出最高水平的举止[4， 8]，并可被多种与醒觉干系的嗅觉输入激活，如触觉、味觉和声息刺激等[4， 9]。基于狂犬病毒的逆行单突触示踪服从标明，DRN神经元接受脑干嗅觉中继核团的输入[10-11]，然而嗅觉中继核团的种类和漫衍偏抓与DRN神经元间的知道模式尚未充分推崇。为此，本有计划接受逆行和顺行神经环路示踪技巧，不雅察DRN神经元接受的脑干嗅觉干系输入，为嗅觉输入参与调控ARAS举止及醒觉步履提供风光学基础。
1 材料与范例 1.1 践诺动物践诺使用成年(8~12周龄)雄性SPF级C57BL/6小鼠， 体质料为25~30 g，购自陆军军医大学践诺动物中心。小鼠饲养于光照/昏昧(12 h/12 h)环境中，目田摄食和饮水，环境温度保管在(22±1)℃。通盘践诺操作严格降服陆军军医大学践诺动物福利和伦理表率， 并尽量减少践诺动物的可怜和使用量。
1.2 范例 1.2.1 神经环路示踪践诺将9只小鼠按飞速数字表法分红3组：DRN+RetroBeads组、臂旁核(parabrachial nucleus， PBN)+AAV-CaMKIIα-EGFP组和PBN+RetroBeads组，每组3只。小鼠手术操作经过参考课题组已发表的责任[12]。小鼠在浓度为2%的异氟烷(瑞沃德公司，中国)中引导麻醉5 min，然后将小鼠固定于单臂数显脑立体定位仪(瑞沃德公司，中国)，手术全程在浓度为1.5%的异氟烷中进行。参照Franklin & Paxinos小鼠脑图谱，当年囟点作为方针脑区定位的坐标零点，对DRN(前囟后4.60 mm，中线旁开0.00 mm，脑膜下深度2.20 mm)和PBN(前囟后5.30 mm，中线旁开1.30 mm，脑膜下深度2.70 mm)进行立体定位。使用玻璃电极(3-000-203-G/X，Drummond Scientific公司，好意思国)吸取50 nL RetroBeads(Lumafluor公司，好意思国)或50 nL AAV-CaMKIIα-EGFP(上海和元生物技巧公司，中国)。按照坐标将玻璃微电极沉着激动到相应位置后停留5 min，打针速度为20 nL/min，打针完成后留针5 min，退避示踪剂漏出和回吸。手术竣事后，缝合皮肤，单笼饲养，赐与弥漫的食品与饮水。密切不雅察小鼠举止情况和精神状况，辞谢非践诺东谈主员战争小鼠，幸免外界搅扰。
1.2.2 灌输与取材RetroBeads打针3 d或AAV-CaMKIIα-EGFP打针10 d后，将小鼠用含4% 多聚甲醛(158127，Sigma公司，好意思国)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS，ZLI-9061，中杉金桥公司，中国)灌流固定。预防将鼠脑取出后，置于4%多聚甲醛中后固定4 h，然后转动到含30%蔗糖(生工公司，中国)的PBS溶液中脱水直至鼠脑十足千里底。使用冰冻切片机(CM1900，Leica公司，好意思国)将延髓到中脑段部分作念连气儿冰冻切片，切片厚度30 μm。
小77文学欣赏 1.2.3 切片制作与符号神经元分析将切好的小鼠脑组织切片每3张取1张(即阻隔90 μm)进行从延髓结尾向中脑端进行连气儿贴片，待其天然风干后，使用含DAPI的防荧光淬灭封片剂(F6057，Sigma公司，好意思国)进行封片。组织切片使用荧显豁微镜(BX53，Olympus，日本)和共聚焦显微镜(Zeiss公司，德国)得到图像，打针位点RetroBeads感染界限向上70%纳入统计。各脑区被符号的神经元数目使用Image Pro Plus软件统计。
1.3 统计学分析接受SPSS 16.0统计软件，以x±s暗示践诺服从。
2 服从 2.1 强劲投射至DRN的脑干嗅觉中继核团种类和漫衍特异性嗅觉传导通路在经过脑干、丘脑(thalamus) 进而上行至大脑皮层(cortex)产生特定嗅觉的过程中，还发出纤维侧支调控ARAS的举止(图 1A)。为了不雅察ARAS内DRN接受的脑干嗅觉中继核团种类和漫衍，向小鼠DRN打针逆行示踪荧光微粒RetroBeads(图 1B)。RetroBeads打针3 d后，灌输固定并分离小鼠脑组织，进行全脑干切片。通过无偏倚的检测RetroBeads符号的神经元并将其地方脑区与圭臬小鼠脑图谱进行比对[14]，进而强劲DRN接受的脑干嗅觉中继核团种类和漫衍模式。在本有计划的践诺条目下，中继躯体和头面触压觉、骨子嗅觉及痛温觉的薄束核(gracile nucleus， Gr)、楔束核(cuneate nucleus， Cu)以及三叉神经嗅觉主核(principal sensory trigeminal nucleus， Pr5)和三叉神经脊束核(spinal trigeminal tract， Sp5)中未发现瓦解RetroBeads符号的神经元(图 1C、D)，领导DRN不径直接受上述嗅觉中继核团的输入。听觉中继核团上橄榄核(superior paraolivary nucleus， SPO)中有少许RetroBeads符号神经元(图 1E)，占DRN脑干总输入的3.11%。其他听觉干系核团如蜗腹侧核(ventral cochlear nucleus， VC)、蜗背侧核(dorsal cochlear nucleus， DC)及斜方体核(nucleus of the trapezoid body， Tz)未发现RetroBeads符号的神经元。在本有计划的践诺条目下，味觉中继核团孤束核头侧(rostral nucleus of the solitary tract， rNTS)与内脏嗅觉中继核团孤束核尾侧(caudal nucleus of the solitary tract， cNTS)中有较多RetroBeads符号的神经元(图 1F)，分别占DRN脑干总输入的2.95%和10.40%。此外，均衡觉中继核团前庭神经核群中前庭内侧核旁细胞部(medial vestibular nucleus， parvicellular part，MVePC)和前庭内侧核巨细胞部(medial vestibular nucleus， magnocellular part，MVeMC)有较多RetroBeads符号的神经元(图 1G)，分别占DRN脑干总输入的10.45%和1.75%。上述服从表示，DRN不接受径直的躯干当作和头面部触压觉、骨子嗅觉以及视觉输入，然而接受味觉和内脏嗅觉中继核团NTS、听觉中继核团SPO以及均衡觉中继核团Ve的径直输入，领导这些嗅觉输入不错径直参与调控DRN神经元在醒觉/休眠周期中的举止。
2.2 PBN与DRN的神经环路有计划特征在本有计划的践诺条目下，通过在DRN打针RetroBeads(图 2A)，发现PBN中外侧臂旁核(lateral parabrachial nucleus，LPBN)和内侧臂旁核(medial parabrachial nucleus，MPBN)有多数RetroBeads符号的神经元(图 2B)，分别占DRN脑干总输入的51.52%和19.81%，标明DRN接受PBN的输入。此外，进一步不雅察投射至DRN的PBN神经元在大脑前后轴径上的漫衍模式。统计分析服从表示，投射至DRN的PBN神经元在其前后轴径上逐渐减少，主要集合在PBN偏前部与中部，在后部漫衍较少(图 2C、D)。为了进一步考据PBN与DRN的环路有计划，接受顺行示踪的范例不雅察PBN神经元末梢在DRN的漫衍情况。为此，在小鼠PBN打针顺行示踪病毒AAV-CaMKIIα-EGFP特异性符号谷氨酸能神经元(图 2E)。病毒感染10 d后，发咫尺DRN内有多数EGFP符号的PBN神经元纤维末梢(图 2F)。以上服从表示，DRN接受PBN的多数神经输入，PBN神经元末梢省略投射到DRN区域。
2.3 强劲投射至PBN的脑干嗅觉中继核团种类和漫衍逆行和顺行示踪践诺服从表示，DRN接受多数(71.33%)来自PBN的输入。基于此，臆想PBN可能是DRN接受脑干嗅觉输入的中间节点，即嗅觉中继核团领先向PBN发出投射，再通过PBN进而投射至DRN(图 3A)。为考据该假定，在PBN打针RetroBeads，不雅察其接受的脑干嗅觉中继核团漫衍情况(图 3B)。与DRN接受的嗅觉输入通常，在味觉中继核团rNTS与内脏嗅觉中继核团cNTS有多数RetroBeads符号的神经元(图 3C)，分别占PB脑干总输入的11.67%和20.53%。同期，在均衡觉中继核团MVePC可见较多的RetroBeads符号神经元(图 3D)，占PB脑干总输入的8.94%。与DRN接受的嗅觉输入不同，在中继头面部痛温觉、触压觉的Pr5和Sp5中发现多数RetroBeads符号的神经元(图 3E、F)，分别占PB脑干总输入的6.14%和49.86%，领导PB接受头面部痛温觉和触压觉输入。此外，还在脑干嗅觉输入中继核团下橄榄核(inferior olive， IO)发现少许符号的神经元(图 3G)，占PB脑干总输入的2.14%。以上服从领导，头面部触压觉、痛温觉，听觉，味觉、内脏嗅觉，均衡觉干系中继核团不错径直或蜿蜒通过PBN来调控DRN的举止，进而参与相应的生理举止。
3 扣问嗅觉输入是保管醒觉系统激昂性的紧要成分。濒临外部环境的嗅觉输入刺激时，省略由休眠转为醒觉状况以及醒觉水平升高，对升迁反应技艺以及保管个体生涯至关紧要[17]。醒觉由迷漫漫衍于脑内的醒觉系统举止死心[1-2]，而嗅觉输入是通过若何的神经环路调控醒觉系统神经核团的举止，咫尺仍未充分推崇。本有计划发现ARAS的DRN神经元接受听觉(SPO)、内脏嗅觉和味觉(NTS)以及均衡觉(Ve)传导通路的径直输入，并可通过PBN蜿蜒接受头面部触压觉、痛觉和温度觉(Pr5、SP5)输入。本有计划是在DRN接受脑干嗅觉中继核团输入的基础上，进一步缜密分离DRN接受的嗅觉中继核团种类偏抓知道模式，为嗅觉输入调控醒觉系统举止提供了神经环路基础。
DRN作为紧要的醒觉脑区，可被多种嗅觉刺激激活。MORIYA等[9]通过在体光纤钙举止记载技巧不雅察DRN 5HT能神经元举止，发现痛觉和温度觉刺激可显贵激活5HT能神经元。此外，CHO等[4]发现听觉、味觉和痛觉等嗅觉刺激提高DRN多巴胺能神经元举止水平，况兼扼制多巴胺能神经元瓦解裁汰听觉刺激诱发的休眠向醒觉盘曲概率。本有计划发现DRN可径直接受来自听觉传导通路中继核团SPO和味觉中继核团NTS的输入，这可能是听觉和味觉刺激激活DRN多巴胺能神经元的神经环路基础。天然DRN不接受痛觉和温度觉的径直输入，但咱们发现其接受多数的与痛觉和温度觉惩办密切干系的PBN输入，领导PBN可能介导痛觉和温度觉刺激对DRN神经元的作用。需要标明的是，由于本有计划使用的逆行示踪荧光微粒RetroBeads不具有细胞遴荐性，下一步需接受细胞特异性的示踪技巧不雅察嗅觉中继核团如何与不同的DRN神经元类型设置突触有计划。
PBN是包括痛痒觉、温度觉、味觉和内脏嗅觉等信息上行传递至大脑皮层的关键部位[13]。本有计划表示PBN接受多数中继味觉和内脏嗅觉的NTS输入以及中继头面部触压觉、痛觉和温度觉的Pr5与SP5输入，与之前的有计划报谈一致[13]。PBN不仅是紧要的嗅觉中继核团，同期也在醒觉调控中具有紧要作用。化学遗传学激活PBN谷氨酸能神经元可通过基底前脑和下丘脑路线促进醒觉[14]，而毁损PBN神经元或局部敲除囊泡型谷氨酸转运卵白则减少醒觉时间[15]。由于痛觉、温度觉和内脏嗅觉刺激会激活PBN神经元，PBN可能所以上嗅觉刺激诱发醒觉的神经节点。此外，外侧PBN抒发降钙素基因干系肽(calcitonin gene-related peptide， CGRP)的神经元还介导了高CO2诱发的醒觉[16]，NTS可能在其中证实了中继作用。
通过对比DRN和PBN接受的脑干嗅觉干系核团输入，咱们发现嗅觉输入与DRN和PBN的有计划线路为如下3种模式，即：同期主管至DRN和PBN，如NTS和Ve，领导内脏嗅觉、味觉和前庭觉等输入可同期径直传递至DRN和PBN神经元；只主管至DRN或PBN，如SPO仅投射至DRN，领导听觉输入径直传递至DRN而非PBN；经PBN中继后进而主管DRN，如Pr5、SP5，领导天然DRN不径直接受头面部嗅觉输入，然而其可经PBN中继后进而影响DRN神经元举止。值得属认识是，DRN不仅径直或蜿蜒接受脑干多个嗅觉中继输入，而且其输入神经元种类可能也存在万般性。举例，PBN不错进一步分离LPBN和MPBN，二者在神经元类型和生理功能上均别离存在。天然PBN主要由谷氨酸能神经元构成，然而LPBN谷氨酸能神经元抒发多种肽类符号物，如强啡肽、胆囊减弱素和速激肽等，主要参与痛觉和温度觉反应[13， 17-18]；而MPBN谷氨酸能神经元主要调控味觉反应[13]。本有计划表示，DRN接受PBN的输入，LPBN和MPBN分别占DRN脑干总输入的51.52%和19.81%。上述知道模式一方面反馈了DRN与脑干嗅觉中继核团知道的复杂性，另一方面也领导嗅觉输入可通过不同路线调控包括DRN在内的ARAS，为格外情况下的嗅觉刺激诱发快速醒觉提供保证。
综上裸舞 twitter，本有计划接受逆行和顺行神经环路示踪技巧，不雅察了ARAS中DRN接受的脑干嗅觉中继核团输入。有计划服从为长远了解嗅觉输入整合至醒觉系统的神经环路机制提供了初步依据。